（圖片來源：Science）

C(sp³)-N鍵廣泛存在于生物活性分子、藥物和功能材料中，因此C(sp³)-N鍵的構(gòu)建是有機(jī)合成中不可或缺的合成過程。在過去十年中，銅催化自由基C(sp³)-N偶聯(lián)成為該領(lǐng)域的主導(dǎo)合成策略。與此同時，生物催化C(sp³)-N鍵構(gòu)建技術(shù)在過去20年快速發(fā)展，通過對轉(zhuǎn)氨酶、亞胺還原酶等的改造，以及將非天然反應(yīng)機(jī)制引入酶體系，實(shí)現(xiàn)了諸如立體選擇性C(sp³)-H鍵胺化、烯烴氫胺化等挑戰(zhàn)性反應(yīng)。將銅催化自由基偶聯(lián)與生物催化相結(jié)合，可兼具酶的選擇性與銅催化的反應(yīng)性，為傳統(tǒng)方法難以實(shí)現(xiàn)的催化胺化反應(yīng)提供新思路。其中，脫羧胺化因其能將豐富羧酸轉(zhuǎn)化為胺類而極具價值。盡管銅催化體系已取得一定的進(jìn)展，但實(shí)現(xiàn)對映收斂的脫羧C(sp³)-N偶聯(lián)仍存在很大挑戰(zhàn)。最近，美國約翰霍普金斯大學(xué)Xiongyi Huang，浙江工業(yè)大學(xué)楊云芳以及美國猶他州立大學(xué)Yi Rao課題組合作開發(fā)了光生物催化新方法，利用銅取代的非血紅素酶的手性環(huán)境以及定向進(jìn)化技術(shù)，高對映選擇性的實(shí)現(xiàn)了芐位C(sp³)-N自由基偶聯(lián)（Fig. 1）。歡迎下載化學(xué)加APP到手機(jī)桌面，合成化學(xué)產(chǎn)業(yè)資源聚合服務(wù)平臺。

（圖片來源：Science）

基于上述理論基礎(chǔ)，作者首先構(gòu)建了非血紅素酶庫進(jìn)行初篩。通過模擬評估多種非血紅素酶活性位點(diǎn)對苯胺和模型底物NHPI酯1a的容納潛力，從中篩選出8種具有適宜活性位點(diǎn)環(huán)境的酶。以NHPI酯1a為底物、苯胺2b為胺偶聯(lián)配偶體、羅丹明B為光催化劑，在過量Cu(II)存在下進(jìn)行脫羧胺化測試。結(jié)果顯示，僅苯丙氨酸羥化酶（CvPAH）表現(xiàn)出初始活性，能以1.1%產(chǎn)率和10%對映體過量（ee）生成目標(biāo)產(chǎn)物。進(jìn)一步評估發(fā)現(xiàn)，N-甲基苯胺2a的活性優(yōu)于苯胺2b（產(chǎn)率1.5%，ee值16%），而烷基胺、酰胺及磺酰胺類均無反應(yīng)活性。對照實(shí)驗(yàn)表明，去除酶催化劑或用牛血清白蛋白（BSA）替代CvPAH時僅得到外消旋產(chǎn)物；鐵、鈷、鎳等金屬僅產(chǎn)生痕量產(chǎn)物，凸顯出銅在該轉(zhuǎn)化中的不可替代性。

在獲得初始活性后，作者們通過定向進(jìn)化改造CvPAH。該酶屬于蝶呤依賴型芳香族氨基酸羥化酶家族（AAAHs），其活性位點(diǎn)包含四氫生物蝶呤（BH₄）輔因子結(jié)合域和柔性底物結(jié)合環(huán)（Fig. 2A）。結(jié)合CvPAH與銅-N-甲基苯胺復(fù)合物的分子動力學(xué)模擬，作者選擇20個活性位點(diǎn)殘基進(jìn)行飽和突變（SSM）篩選。采用GC-MS初篩結(jié)合手性HPLC立體選擇性驗(yàn)證的策略，優(yōu)先保留ee值提升的突變體。在進(jìn)化工程啟動前，實(shí)驗(yàn)室已有突變體庫篩選獲得F107L/Y130P雙突變體，其ee值提升至66%。以此為母本進(jìn)行多輪SSM篩選，最終獲得五重突變體CvPAH F107L/Y130S/W180A/P134L/Y179W（簡稱CvPAH-胺化酶），能以19%產(chǎn)率和94% ee值生成產(chǎn)物3a（Fig. 2B）。分子模擬顯示，突變導(dǎo)致活性腔體積擴(kuò)大1.4倍，形成單一擴(kuò)增空腔更利于底物1a的容納（Fig. 2C）。

（圖片來源：Science）

在獲得最終變體后，作者通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)提高了產(chǎn)率。質(zhì)譜分析表明，80%的NHPI酯1a通過氧化還原活化消耗，但僅16%轉(zhuǎn)化為目標(biāo)胺化產(chǎn)物。系統(tǒng)優(yōu)化顯示羅丹明B是最佳光催化劑，銅離子濃度過高會降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。最終確立的最優(yōu)條件為：1.25 mM硫酸銅、5.0 mM抗壞血酸、10 mM N-甲基苯胺、45 mM NHPI酯1a和100 μM羅丹明B，使用OD₆₀₀ = 50的全細(xì)胞裂解液時，在4 ^oC下反應(yīng)6-24小時，產(chǎn)物3a收率達(dá)92%，對映選擇性為94% ee。對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)CvPAH酶的關(guān)鍵作用，且粗酶液效果優(yōu)于純化蛋白。

底物拓展研究表明，NHPI酯芳環(huán)上的取代基顯著影響反應(yīng)效率（Fig. 3）：對位異丁基導(dǎo)致產(chǎn)率和對映選擇性下降（3f），芐位修飾產(chǎn)生明顯差異（3g-3i），非芐基羧酸衍生物無反應(yīng)活性（1b）。以1a為模型底物時，苯胺類胺化偶聯(lián)部分的耐受性較好（產(chǎn)率 > 40%，ee > 90%），但芐胺會完全抑制反應(yīng)并生成酰胺副產(chǎn)物5。該策略還可兼容四氯-N-羥基鄰苯二甲酰亞胺酯9（產(chǎn)率60%，ee 90%）和Katritzky鹽等自由基前體。此外，肟酯6則產(chǎn)生開環(huán)胺化產(chǎn)物7（產(chǎn)率5.1%，ee 42%）。雖然烷基胺適用性有限，但這些發(fā)現(xiàn)證明了CvPAH平臺與多種自由基生成策略結(jié)合的潛力（Fig. 3）。

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最后，作者通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了這種光生物催化脫羧胺化反應(yīng)的機(jī)理（Fig. 4）。研究發(fā)現(xiàn)，無論是外消旋還是手性NHPI底物，酶都能將其有效轉(zhuǎn)化為非手性底物構(gòu)建C-N鍵，且產(chǎn)物對映體過量始終保持在94% ee。自由基捕獲實(shí)驗(yàn)和環(huán)丙基自由基鐘底物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了碳中心自由基的參與。熒光光譜分析表明，光激發(fā)態(tài)RhB*與抗壞血酸鹽（AH^?）之間最可能發(fā)生初始單電子轉(zhuǎn)移，生成的RhB^??進(jìn)一步將CvPAH中的Cu(II)還原為Cu(I)。色氨酸熒光淬滅實(shí)驗(yàn)顯示CvPAH-胺化酶對Cu²⁺的結(jié)合親和力（K_d = 2.52 μM）弱于野生型（K_d  = 0.48 μM），且對6-生物蝶呤的結(jié)合能力也降低。關(guān)鍵突變研究表明，179位和180位殘基對維持酶活性和立體選擇性具有協(xié)同作用，且W179A突變使產(chǎn)率從92%降至8%，ee值從94%降至10%；而A179/W180雙突變則幾乎完全喪失酶活性。這些發(fā)現(xiàn)為理解該光酶催化體系的反應(yīng)機(jī)制提供了重要依據(jù)，但關(guān)于自由基生成位點(diǎn)等具體機(jī)制仍需通過瞬態(tài)吸收光譜等進(jìn)一步研究闡明。

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Xiongyi Huang，楊云芳和Yi Rao課題組提出了一種脫羧形成C?N鍵的生物催化新策略，證實(shí)了多環(huán)芳烴羥化酶（PAHs）可作為對映選擇性自由基C?N成鍵的強(qiáng)大催化平臺。首次實(shí)現(xiàn)了酶催化的自由基C(sp³)?N偶聯(lián)反應(yīng)，填補(bǔ)了生物催化與合成催化之間的空白。通過將該金屬酶平臺與不同自由基生成機(jī)制相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)多種自然界尚未發(fā)現(xiàn)的生物催化胺化反應(yīng)。